Fondata da Pio VI (pontificato 1775-99) e sistemata, in un primo tempo, nell'attuale Galleria degli Arazzi, solo nel 1932 essa fu definitivamente collocata nella sede progettata dell'architetto Luca Beltrami su invito di Pio XI (pontificato1922-1939).
La galleria annovera opere di Giotto, Gentile da Fabriano, Beato Angelico, Perugino, Pinturicchio, Leonardo, Tiziano, Guercino, van Dyck, Poussin ed altri.